Лабораторная диагностика малярии

Малярия — группа трансмиссивных инфекционных заболеваний, передаваемых человеку при укусах комаров рода Anopheles.

Предварительный диагноз малярии устанавливают на основании клинико- эпидемиологических данных, подтверждается он обнаружением плазмодиев малярии в крови. В эндемических очагах наблюдается тенденция к гипердиагностике малярии, что, однако, гораздо менее опасно, чем гиподиагностика вне эндемических очагов при завозе малярии.

Определенную помощь в диагностике могут оказать результаты общего анализа крови. В результате массового распада эритроцитов у больного малярией возникает гемолитическая анемия, гипербилирубинемия, в связи с чем кожа и слизистые оболочки больного приобретают желтушную окраску. Однако в первые дни болезни она может отсутствовать, даже в первую неделю обычно не выражена, так как потеря какой-то части эритроцитов вследствие гемолиза компенсируется выбросом крови из депо организма.

В результате активизации эритропоэза повышается число ретикулоцитов, возникает полихроматофилия.

Со стороны белой крови для малярии характерны лейкопения, нейтропения, эозинопения, относительный лимфоцитоз. В затянувшихся случаях моноцитоз. Высокий лейкоцитоз при малярии встречается очень редко, в основном при злокачественном течении тропической малярии. Поэтому при наличии лейкоцитоза вообще правильнее думать о другой болезни, а не о малярии, кроме пернициозных её форм.

Характерные для малярии высокие показатели СОЭ так же, как и анемия, выявляются при значительной длительности болезни. В ранние сроки СОЭ может оставаться в пределах нормы, что не должно дезориентировать врача.

В практической работе при исследовании крови на наличие малярийных плазмодиев пользуются, в основном, методом толстой капли. Преимущество этого метода заключается в том, что для приготовления толстой капли используется в 30—50 раз больше крови, чем для тонкого мазка, и поэтому концентрация паразитов в одном поле зрения толстой капли в десятки раз больше, чем в мазке. Следовательно, обнаружить паразитов в толстой капле значительно легче, чем в мазке, что особенно важно при скудной паразитемии. Толстые капли окрашивают без предварительной фиксации, поэтому эритроциты при промывании водой выщелачиваются и паразиты деформируются, в связи, с чем установить вид паразита иногда трудно. В таких случаях требуется дополнительное исследование мазка, который фиксируют перед окраской. В нем хорошо видны детали морфологии паразита и изменения пораженных эритроцитов. Для паразитологического подтверждения диагноза малярии необходимо обнаружение бесполых стадий развития паразита, т.е. трофозоитов и шизонтов.

Паразиты обнаруживаются в крови, как на высоте приступов болезни, так и в промежутках между ними.

Серологическая диагностика малярии. Малярийные антитела появляются в крови после 2-3-го приступа, достигают максимального уровня на 4-6 неделе, затем при отсутствии реинфекции титр их постепенно снижается, сохраняясь на низком уровне в течение 6 мес. и более. Выявляют их с помощью реакции непрямой флюоресценции, РНГА, реакции энзиммеченных антител. Для постановки РНИФ необходимы специфические антигены, в качестве которых используются толстые капли инфицированной крови, содержащей паразитов малярии человека или обезьян, которые по антигенной структуре близки паразитам человека, и сыворотки против IgG человека, меченные изотиоцианатом флюоресцеина. Нижний порог специфической для малярии реакции равен, по данным разных авторов, 1:20, 1:80, 1:160.

Результаты РНГА считаются положительными в разведении 1:40 и выше. При сравнительном изучении установлено, что РНГА уступает РНИФ в чувствительности и специфичности в ранние сроки — первые 2 недели болезни.

В последние годы для диагностики паразитарных болезней, в том числе малярии, используют новый перспективный серологический тест — РЭМА. Основу метода составляет использование антигенов или антител меченных ферментами. Для диагностики малярии в РЭМА используется растворимый антиген из эритроцитарных паразитов. РЭМА отличается высокой чувствительностью и точностью учета результатов с помощью инструментальных методов — на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре. Большинство серологических методов диагностики малярии (пассивная гемагглютинация, преципитация в геле, связывание комплемента и др.) не получили широкого распространения вследствие сложной методики их постановки, необходимости специальной подготовки персонала, наличия особого лабораторного оснащения и стандартизированных антигенов, а также из-за недостаточной специфичности результатов. Даже наилучший из этих методов — метод непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), играет в лабораторной диагностике малярии лишь второстепенную роль.

Во всех случаях диагностики малярии основной является паразитологическая диагностика путем приготовления и изучения препаратов толстой капли и тонкого мазка.

Заведующий КДЛ детской поликлиники

И.И. Булах

• < Назад
• Вперёд >

Приемная главного врача
(+375 214) 50-62-70
(+375 214) 50-62-11 (факс)

В организме человека могут паразитировать и вызывать заболевание четыре вида возбудителей малярии: Plasmodium vivax — возбудитель трехдневной малярии, Plasmodium malarjae — четырехдневной малярии, Plasmodium falciparum — тропической малярии и Plasmodium ovale — возбудитель, подобный возбудителю трехдневной малярии.

Комары рода Anopheles maculipennis (самки) переносят возбудители малярии от больного человека здоровому. При укусе со слюной комара в подкожную клетчатку человека попадают спорозоиты, которые в дальнейшем развиваются в клетках мезенхимного происхождения — тканевая шизогония. После этого сформировавшиеся молодые тканевые мерозоиты (криптозонты) проникают в эритроциты и там проходят бесполый цикл развития — эритроцитарная шизогония. При трехдневной малярии, наряду с внедрением тканевых мерозоитов в эритроциты, часть их снова попадает в клетки ретикулоэндотелиальной системы, где повторяет беспигментный (тканевой) цикл развития (параэритроцитарные формы).

Для тропической малярии параэритроцитарные формы не характерны.

Тканевые мерозоиты проникают в эритроциты человека, где происходит их дальнейшее развитие — шизогония. Юные шизонты в эритроците представляют собой овальные тельца, состоящие из ядра, протоплазмы и пищеварительной вакуоли. При окраске препарата по методу Романовского — Гимзы паразит напоминает перстень, так как ядро окрашивается в красный цвет, а протоплазма в синий. Такую форму паразит имеет в течение 6—8 ч. Затем протоплазменная часть увеличивается и появляется железосодержащий пигмент меланин или гемосидерин, который образуется при переработке гемоглобина плазмодием. Возбудитель растет, взрослый шизонт занимает почти весь эритроцит. Плазмодий округляется, движение его прекращается, начинается деление ядра — стадия морулы. Пигмент концентрируется в центре клетки. При делении ядра и протоплазмы образуется 16—20—24 мерозоитов. В последующем оболочки эритроцитов и морулы разрушаются и мерозоиты попадают в плазму крови. Сохранившиеся в плазме мерозоиты внедряются в новые эритроциты, повторяя бесполый цикл развития. Через 3—5 циклов шизогонии из некоторых мерозоитов образуются половые клетки — гаметоциты (мужские и женские) (рис. 28).

Дальнейший половой цикл развития гаметоциты проходят при попадании в организм самки комара анофелес.

В желудке комара происходит слияние микрогамет (мужских половых клеток) и макрогамет (женских), в результате образуется зигота, которая превращается в подвижную клетку — оокинету. Оокинета проникает под серозную оболочку желудка комара и там превращается в ооцисту, а затем цисту, заполненную спорозоитами. Циста лопается и спорозоиты с лимфой распространяются по всему телу комара, попадая также в его слюнные железы. Только теперь комар может заражать человека при укусе. Спорогония протекает при температуре внешней среды не ниже +16°С, а для возбудителя тропической малярии — не ниже +18°С.

Для лабораторного подтверждения диагноза из крови больного готовят мазок и толстую каплю, в которой вероятность обнаружения возбудителя большая (одно поле зрения толстой капли соответствует 50 полям тонкого мазка). Для идентификации возбудителя исследуют и мазок.

Толстую каплю готовят следующим образом. На предметное стекло наносят 2—3 капли крови и размазывают ее до диаметра десятикопеечной монеты. Кровь подсушивают на воздухе, затем к ней добавляют дистиллированную воду для удаления из эритроцитов гемоглобина, вновь подсушивают, окрашивают по Романовскому — Гимзе на протяжении 45 мин, после чего краску смывают, препараты подсушивают и микроскопируют.

Чтобы приготовить мазок, на край предметного стекла наносят небольшую каплю крови. Вторым стеклом со шлифованным краем равномерно размазывают кровь так, чтобы получился тонкий препарат (мазок). Мазок высушивают, фиксируют смесью Никифорова, а затем окрашивают краской Романовского — Гимзы в течение 30 мин, смывают водой, подсушивают и микроскопируют.

Микроскопируя препараты, распознают вид плазмодия. Эритроциты, в которых находятся возбудители трехдневной малярии, увеличены в размерах (в 1,5 раза), бледнее окрашены, по сравнению с эритроцитами, свободными от плазмодиев. В пораженных плазмодиями эритроцитах появляется нежная, равномерно красного цвета зернистость, распределяющаяся по всему эритроциту (шуфнеровская зернистость). Шизонт амебовидной формы, стадия морулы имеет вид тутовой ягоды. Эритроциты, которые содержат возбудителей четырехдневной малярии, в размерах не увеличиваются. В первые 10 ч паразит имеет форму кольца, меньших размеров, чем возбудитель трехдневной малярии, затем шизонт принимает форму ленты, расположенной поперек эритроцита. В этой стадии паразит занимает 1/2—1/3 объема эритроцита, ядро лежит на краю ленты. Стадия морулы имеет форму розетки и включает 6—8—10 мерозоитов. Пигмент золотисто-желтого цвета.

Форма и размеры эритроцитов при тропической малярии не изменяются. В периферической, крови взрослые шизонты и формы их деления не встречаются, так как эти стадии происходят в кровеносных капиллярах внутренних органов, мозга пристеночно. Это самый мелкий паразит из всех возбудителей малярии. В стадии деления он не занимает диаметра эритроцита. В периферической крови можно обнаружить юные шизонты в виде колец, по 2—4 в одном эритроците, и половые клетки. В эритроцитах с паразитами появляется грубая зернистость в виде пятен неправильной формы пурпурно-красного цвета (мауреровская пятнистость). Диагноз ставится на основании обнаружения в периферической крови юных шизонтов (по 2—3 в одном эритроците) или взрослых гаметоцитов, которые имеют вид полулуния либо сигары. Ядро в этих клетках расположено посередине и окружено зернами пигмента черно-коричневого цвета.

Понятие о заболевании

Малярия представляет собой опасное инфекционное заболевание, которое вызвано простейшими, рода плазмодий. Инфекция попадает в организм постоянного носителя, которым выступает человек, через кровь.

Болезнь передается несколькими путями, самым частым из них является укус самок нескольких видов комаров. Источником заражения является заболевший человек или переносчик заболевания.

Малярия чаще всего диагностируется в тех местах, где наблюдаются комфортные условия для жизнедеятельности насекомых. Благоприятная среда для комаров определяется местностью с повышенным уровнем влажности и с высокими показателями температуры окружающей среды.

При условии, что температура понизилась до 15 градусов цельсия, распространение плазмодий в организме комара прекращается.

Отмечается, что все виды простейших, вызывающих малярию, практически схожи, существуют лишь некоторые особенности между ними. Основной схожестью между плазмодиями определяют возможность их проникновения в кровь человека и комара.

Лабораторная диагностика малярии помогает определить, какой именно вид возбудителя инфекции проявился у зараженного человека. Согласно результатам исследований, врач выбирает подходящие препараты для эффективного лечения.

Категорически запрещается начинать самолечение такой опасной инфекции, потому что это действие практически всегда приводит к серьезным последствиям, которые могут быть необратимы.

Содержание

1. Область применения. 4

2. Общие положения. 4

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов. 5

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики

малярии и бабезиозов . 5

4.1. Подготовка предметных стекол . 5

4.2. Приготовление и хранение реактивов. 6

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию. 7

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация. 7

4.5. Окраска препаратов крови. 10

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови. 12

5. Микроскопическая диагностика возбудителей мазярии и бабезиозов. 13

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии. 13

5.2. Алгоритм просмотра препаратов крови на малярию. 24

5.3. Изменения морфологии паразита и пораженных эритроцитов,

возникающие в процессе приготовления и окраски препаратов крови. 25

5.4. Изменения морфологии паразита, связанные с воздействием

химиотерапевтических препаратов. 25

5.5. Источники диагностических ошибок. 26

5.6. Оценка интенсивности паразитемии. 26

5.7. Учет результатов исследования и оформление ответа. 28

5.8. Порядок исследования препаратов крови, контроля

и направления результатов на подтверждение. 29

5.9. Паразитологический контроль за эффективностью лечения. 31

5.10. Морфологические признаки возбудителей бабезиозов. 32

6. Иммунохроматография в лабораторной диагностике (экспресс-тесты). 34

7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 35

npiuoxcemie I. Необходимые реактивы и оборудование. 37

Прнюжение 2. Возбудители паразитозов под воздействием

противомалярийных препаратов в тонких мазках и толстых каплях. 38

Прнюжение 3. Элементы крови, контаминанты и образования.

симулирующие малярийных паразитов. 41

Пртожение 4. Приготовление толстой капли на плёнке

для создания учебных коллекций по А. Е. Беляеву (1981). 42

Руководитель Федератьной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

22 сентября 2014 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ